海洋微生物拥有极其丰富的多样性，是海洋药物、新型酶制品的重要来源。目前海洋微生物来源的新天然产物已经占新发现海洋活性物质三分之一以上，是巨大的潜在药用资源。但是99%以上的海洋微生物无法通过传统技术在实验室中培养，这类微生物被称为“未/难培养”微生物或微生物“暗物质”，因此，目前已研究的海洋微生物仍然是“冰山一角”。尽管近年来宏基因组学、单细胞测序等技术突飞猛进，测序成本大幅下降，免培养策略在海洋微生物研究中发挥越来越大的作用。但是，在微生物系统鉴定、生理生化过程、活性物质和功能酶挖掘等方面仍然依赖于获得微生物的纯培养。急需开发和运用新培养技术，以提高海洋微生物的可培养率，拓展海洋微生物新资源。

2021年4月30日，宁波大学8040www威尼斯-apple app store，李达三海洋生物医药研究中心何山课题组，在Microbial Biotechnology期刊发表题为：Accessing previously uncultured marine microbial resources by a combination of alternative cultivation methods的研究论文。

该论文报道了一种海洋微生物培养新策略，整合运用了三种新型微生物培养技术方法：（1）Diffusion Chambers (DC) 扩散室原位培养技术，为培养驯化过程提供原位化学信号分子；（2）Dilution-to-Extinction culture (DTE) 极限稀释法，不存在传统技术中微生物之间的相互竞争与抑制；（3）Modified agar preparation step (PS media) 改良琼脂制备法，避免在琼脂平板制备过程中产生H₂O₂。从海洋环境样品中分离培养得到的菌株中，潜在新物种（即16S rRNA序列与最接近的物种相似性小于97%）的比例分别为28%、48%、33%，均显著高于传统培养技术（9%）。说明该策略培养获得海洋微生物新种的概率大幅提高。

在多样性方面，新培养技术组共培养获得75个属，占样品总微生物多样性45%（二代测序共检测到168个属），而传统培养技术对照组只获得了28个属。也就是说，样本中约一半的属能够通过新的培养策略获得。在科的层面，有42个科只在新技术培养组中出现（其中新种比例高达60%），29个科为新技术组和传统技术对照组共有，只有3个科仅出现在传统技术组。同时也注意到，样本中的两个门类Acidobacteria和Deltaproteobacteria在各组中均未出现，可能这些门类的培养需要专门的培养条件，也可能是目前研究的培养规模还不够大，尽管这两个门类在二代测序结果中比例并不低。此外，该研究还发现，不同培养技术获得的微生物门类往往差别很大，而重复很少，因此，整合运用多种技术就能形成优势互补，获得更完整的微生物培养组。比如，生长缓慢的微生物比较适合极限稀释法培养，因为可以避免快速生长菌的干扰。

基于以上结果，研究人员提出整合运用多种基于不同原理的微生物培养新技术，获得的微生物资源无论是多样性还是新颖性均远高于传统技术，该研究共获得了201个潜在新种纯培养，其中不乏Actinobacteria和Verrucomicrobia等具有生物技术开发潜力的门类，目前正在开展活性物质研究。部分菌株16S rRNA序列与最近物种的相似度小于91%，可能是新颖的高阶分类单元，有待进一步系统分类鉴定。综上所述，该研究提出的技术方案是培养获得海洋“未培养”微生物的高效策略，将有助于深入挖掘海洋微生物“暗物质”，助力“蓝色药库”。

 该项研究得到了国家自然科学基金、海洋生物医药国家111引智基地、宁波大学李达三叶耀珍伉俪李本俊海洋生物医药发展基金的资助。作者感谢斯拉瓦·爱泼斯坦教授的有益探讨。

论文链接：

https://sfamjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/1751-7915.13782